دانلود رایگان مقاله الکتروفورز

    —         —    

ارتباط با ما     —     لیست پایان‌نامه‌ها

... دانلود ...

بخشی از متن دانلود رایگان مقاله الکتروفورز :

الکتروفورز

امروزه الکتروفورز شاید اصلی ترین تکنیک برای جداسازی ملکولها در آزمایشگاه‌های سلولهای زیستی است. زیرا تکنیک قدرتمندی است و هنوز به طور معقولانه ای آسان و ارزان است و خیلی آسان و پیش پا افتاده شده است. علی رغم بسیاری از آرایش های فیزیکی برای دستگاه ها و صرف نظر از محیطی که ملکولها اجازه مهاجرت در آن دارند جداسازی با الکتروفورز به توزیع بار در ملکولی که جداسازی می شود بستگی دارد. الکتروفورز می تواند یک بعدی یا دو بعدی باشد. الکتروفورز یک بخشی برای جداسازی اغلب پروتئین‌های روتین و اسید نوکلئیک استفاده می شود. بخش دوم الکتروفورز برای جداسازی پروتئین هایی که در اثر انگشت هستند استفاده می شود. محیط کمکی برای الکتروفورز می تواند در ژل در لوله یا در ورقه های صاف خوابیده تشکیل شود لوله ها برای جداسازی یک بعدی استفاده می شوند و زمانی که ورقه ها فضای سطحی بلندی را اشغال می کنند برای جداسازی دو بعدی بهترند. شکل 1-4 نوعی واحد الکتروفورز ورقه ای تخت را نشان می دهد. زمانی که دیترجنت SDS سدیم دو دسیل سولفات با پروتئین ها استفاده می شود, همه پروتئین ها دارای بار منفی می شوند به وسیله وابستگی به آنیون سدیم دودسیل سولفات در زمان جدا سازی با ژل پلی آکریلامید طرز عمل و رویه با پلی آکریلامید ژل الکتروفورز خلاصه می شود این تکنیک برای تعیین وزن مولکولی استاندارد شده است. ژل های پلی آکریلامید از پلیمریزه کردن دو ترکیب تشکیل شده اند. آکریلامید و N , N متیلن بیس آکریلامید.

بیس در اینجا عامل پیوند دهنده برای ژل هاست. پلیمریزاسیون با اضافه کردن آمونیوم پرسولفات در زمانی که همچنین دی متیل آمینوپرپیونیتریل یا N , N , N , N تترامتیل اتیل اندیامین آغاز می شود. ژل ها خنثی و هیدروفیل هستند و شبکه سه بعدی از هیدروکربن های طولانی که به وسیله گروه های متیلن به هم وصل شده اند تشکیل شده است جداسازی ملکول ها در ژل بستگی به اندازه منفذها و سوراخهای تشکیل شده در ژل دارد. اندازه سوراخهای ژل به وسیله دو فاکتور تعیین می شوند. %T که مقدار درصد آکریلامید را نشان می دهد. %30 که مقدار درصد پیوند دهنده را نشان می دهد. هر چه مقدار کل آکریلامید افزایش یابد اندازه منفذ ژل کاهش می یابد. پیوند دهنده های با 5% C کوچکترین اندازه منفذ را می دهد. هر افزایش یا کاهش در %C باعث افزایش در اندازه منفذ می شود. کل آکریلامید داده شده بعنوان نسبت درصد وزن به حجم از آکریلامید+بیس آکریلامید است.

پروتئین ها با وزن مولکولی در محدوده ده هزار یا یک میلیون با 2/71% ژل های آکریلامید جداسازی می شوند. زمانی که پروتئین ها با وزن ملکولی بالاتر نیازمند تمرکز ژل آکریلامید پایین تر هستند برعکس ژل های 30% برای جداسازی پلی پپتیدهای کوچک استفاده می شود.
تمرکز بیشتر ژل باعث کوچکتر شدن اندازه منفذ ژل و جداسازی بهتر ملکولهای کوچک می شود. درصد ژل مورد استفاده بستگی به وزن مولکولی پروتئین مورد جداسازی دارد.
ژل های 5درصد برای پروتئین هایی در محدوده 60000 تا 200000 دالتون استفاده می شوند. ژل های ده درصد برای پروتئین های 16000 تا 70000 دالتون استفاده می شوند و ژل های پانزده درصد برای پروتئین های 12000 تا 45000 دالتون استفاده می شوند.

سیستم های کاتیونی و آنیونی
در الکتروفورز پروتئین ها در یک بار پایه جداسازی می شوند و بار پروتئین می تواند مثبت یا منفی باشد.بسته به PH بافر. در عملیات معمولی ستون حاوی ژل قیمت بندی شده در سه قسمت شامل: 1- ژل جدا کننده 2- ژل توده شده 3- ژل نمونه . ژل نمونه ممکن است حذف بشود و نمونه از طریق غلیظ شدن محیط غیر هدایتی مانند ساکاروز به وجود بیاید. الکترودها به دو انتهای ستون متصل می شوند و جریان الکتریکی از طریق ژل جز بندی شده عبور می کند. اگر الکترودها به صورت بالا آرایش پیدا کنند حمام بالایی کاتد و حمام پایین آند (+) است.
آنیون ها اجازه دارند که به سمت آند بروند و به این سیستم آنودی می گویند. کاتیون ها اجازه دارند که به سمت کاتد بروند و به این سیستم کاتدی می گویند.

سیستم های لوله ای و ورقه ای
در طراحی پروتکل الکتروفورز دو سیستم نزدیک به هم طراحی شده است یکی ستون الکتروفورز که از ژلهای لوله مانند در لوله های شیشه ای تشکیل شده است و دیگری ژل های تخت که از ژل تخت بین دو صفحه شیشه ای تشکیل شده است. مزایای ژل های تیوبی در حرکت ملکولها از طریق ژل ها کمتر مستعد و مهیاست تا حرکت افقی و بنابراین گسترش آرامی در تجزیه و تحلیل باندها به خصوص در پروتئین ها وجود دارد و از نظر اقتصادی هم به صرفه است زیرا نسبتا آسان است برای ساختن این سیستم می توان در خانه از مواد قابل دسترس استفاده کرد.

با وجود اینکه ژل های تخت مزایایی دارند که اجازه می دهند برای تجزیه های دو بعدی از آنها استفاده شود جدا کردن چندین نمونه به طور همزمان در یک ژل وجود دارد. ژل های تخت طوری طراحی شده اند که چندین راه باریک دارند که نمونه ها به طور موازی حرکت کنند. اندازه و تعداد راه ها می تواند مختلف باشد زمانی که نمونه ها در یک محیط حرکت می کنند کمترین همانندی نمونه های مختلف منجر به تغییرات جزئی در ساختار ژل می شود. ژل تخت تکنیکی برای تجزیه های لکه‌ای و تجزیه های اتورادیوگرافیک است. نتیجتا برای عملیات آزمایشگاهی روزمره مثل تجزیه نوکلئیک اسیدها و کنترل های آنتی ژنی ژل های تخت مناسبند. قابلیت استفاده و قیمت تجاری ژل تخت باعث استفاده بیشتر از اینها شده و به ندرت از ژل لوله ای استفاده می شود. تئوری و عملیات ژل تخت با ژل لوله ای الکتروفورز یکسان است و این که از کدام سیستم استفاده کنیم بستگی بیشتر به تجهیزات موجود دارد.

سیستم های ژل دنباله دار و بدون دنباله
استفاده اصلی از ژل ها بعنوان محیط جدا کننده که شامل استفاده از یک ژل با پوشش PH است. مولکولها به وسیله حرکتشان در پایه از طریق ماتریکس ژل تنها جدا می شوند این سیستم امروزه فقط گاهی در آزمایشگاهها استفاده می شود. و با سیستم های ژل چندتایی بدون دنباله جایگزین شده است. در سیستم های ژل چندتایی ژل جدا کننده به ژل توده ای و ژل نمونه انتخابی اضافه می شود. این ژل ها می توانند تجمع متفاوتی در یک محیط کمکی داشته باشند. یا ممکن است به طور کلی عامل های متفاوتی داشته باشند. تفاوت کلیدی در جداسازی ملکولها زمانی که آن ها به ژل جدا کننده وارد می شوند است ژل جدا کننده تجمع خواهند کرد. این منطقه در ژل توده کننده در محدوده میکرون تا میلیمتر است. زمانی که پروتئینها در باندهای تجمع توده می شوند آنها به مهاجرت ادامه می دهند برای رسیدن به ژل جداکننده تا باندهای باریک تشکیل دهند. باندها سپس از یکدیگر جدا می شوند.

ژل PH بدون دنباله
ابتدا باندهای پروتئین به ژل جدا کننده وارد می شوند جداسازی باندها با یون های عبوری از طریق ستون ژل در جفت افزایش می یابد هر یون در این جفت دارای پلاریته بار یکسان مانند پروتئین هستند. ولی متفاوت در بزرگی بار هستند. یک یون بزرگی بار بیشتی از پروتئین دارد. در حالی که دیگری بزرگی بار کمتری از پروتئین دارد. یونی که بار بیشتری دارد تندتر حرکت می کند و بنابراین یون رهبر خواهد بود و یون با بار کمتر یون دنباله رو خواهد بود در سیستم های آنیونی یونهای کلر و گلیسینات از مخزن بافر (تریس گلیسین) مشتق می شوند یون رهبر معمولا کلر و گلیسینات یون دنباله رو است طرح این سیستم آنیونی در شکل 4-3 نمایش داده شده است. یون کلر اول به ژل جدا کننده وارد می شود و به سرعت از ژل خارج می شوند سپس پروتئین و بعد یون گلیسینات یون گلیسینات پروتئین را خارج می سازد و در آخر یک پوشش گرادیان ولتاژ خطی با ژل می سازد. پروتئین ها سپس خودشان را با این شیب بر طبق بار و اندازه شان جور می کنند.

ژل های آگارز
زمانی که ژل های آکریلامید برای تجزیه پروتئین ها استاندارد شدند آنها کمتر برای اسیدهای نوکلئیک با وزن مولکولی بالا مناسب بوده اند به این منظور برای جداسازی مناسب این مولکولهای بزرگ تجمع آکریلامید نیاز به کاهش تا سطحی که مایع باقی بماند دارد.
ژلها می توانند تشکیل بشوند با وجود اینکه آگارز اضافه شود (آگارز یک پلی ساکارید طبیعی است) برای کاهش تجمع آکریلامید. با اضافه کردن آگارز تجمع آکریلامید 5% می شود و می توان برای ملکولهای با وزن ملکولی بالاتر از 10 دالتون جداسازی کرد. این روش مخصوصا برای جداسازی ترتیب طولانی از DNA مفید است. امروزه ژل های آگارز- آکریلامید به طور گسترده در آزمایش‌گاه‌های ژنتیک برای تعیین نقشه ژن ها استفاده می شود این فصل بروی جداسازی پروتئین ها متمرکز است.

ترمینولوژی برای تکنیکهای تجزیه ای, مهاجرت الکترونی با لوله موئینه:
تکنیهای مهاجرت الکترونی با لوله موئینه به طور افزاینده ای در شیمی تجزیه محبوب و مهم شده اند به خصوص در بیوتجزیه . بعضی از ترمینولوژی های وابسته در کاغذ یافت می شوند در ترمینولوژی الکتروفورز در شیمی کلینیکی. اما در بسیاری از موارد اینها برای تکنیکها کاپیلاری کاربردی نیستند و در تعاریف آیوپاک به حساب نمی آیند. در 1994 آقای KNOX مقاله ای را در زمینه تکنیکهای جداسازی الکترونی منتشر کرد اما این مقاله هماهنگ با فهرست علائم کروماتوگرافی آیوپاک نبود مقاله جاری بحث می کند و تعریف می کند جمله های وابسته مورد نیاز در تامین جاری, شامل نامهای تکنیکهای مختلف که در اصول مهاجرت الکترونی استفاده می شود و آن باید مورد توجه قرار بگیرد که تعداد موارد مرزی موجود با ترتیب و احترام به نامگذاری تکنیک های مخصوص اقدام کند. جداسازی با تکنیک های مهاجرت الکترونی کاپیلاری در لوله موئینه باریک به وسیله اعمال میدان الکتریکی قوی به دست می آید این تکنیکها شامل کاپیلاری الکتروفورز و مشتقات تکنیکهای مهاجرت الکترونی کاپیلاری است که بر پایه اصول جداسازی متفاوت اند.

در بعضی موارد این اصول دارای هم پوشانی هستند. میسلار کاپیلاری الکتروفورز برای جداسازی یونهای کوچک آلی و معدنی و پلیمرها رنگها, منفجر کننده ها, پروتئینها, پپتیدها و اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود. جریان الکترواسمز برای جداسازی همکاری می کنند اگر چه همیشه مورد نیاز نیست. جریان الکتروسمز از تاثیر میدان الکتریکی بر روی بارها در قسمت پخش شده در لایه دوگانه در سطح داخلی کاپیلاری به وجود می آیند برای مثال در کاپیلاری فیوز سیلیکا در برخورد با بافر در PH بالای 2 سطح گروه های سیلانول دپروتونه شده و پروتون از دست می دهند و دیواره کاپیلاری بار منفی پیدا می کند. این گروه ها اتمسفر یونی را بالا می برند کاربرد میدان الکتریکی در کاپیلاری باعث می شود یونهای دارای بار مثبت به سمت کاتد حرکت کنند و آنیونها به سمت آند حرکت کنند مزایای الکترواسمز شامل موارد زیر است:

1- جداسازی خوب است
2- زمان جداسازی کوتاه است
3- مقدار نمونه مورد نیاز بسیار کم است
4- هزینه تجزیه ای کم است

لینک کمکی